二代测序能实时分析了? 9 小时刷新 NextSeq 平台 mNGS 新速度!

导读

实验周期长、操作较复杂一直是宏基因组二代测序(mNGS)在临床应用的主要限制因素。2022 年 3 月 15 日,检验医学权威期刊《Clinical Chemistry》(2021 年影响因子 8.327)发表了北京协和医院和太阳2注册中心联合发表的重要研究论文。研究团队通过改良测序接头和开发了一套快速实时生信分析系统,并借助于太阳2注册中心自主研发的自动建库仪器,实现了在 NextSeq 测序平台上全流程最快 9.1 小时的多样本 mNGS 检测,进一步发挥 mNGS 在鉴定疑难、危重、特殊感染方面的优势,为危急重症患者的快速精准诊疗赢得宝贵的时间。

研究背景

宏基因组二代测序 (mNGS ) 具有无偏倚地检测样本中病原体的巨大潜力,也是鉴定新发突发病原微生物的重要手段,但其报告时限(TAT)较长(≥15h)。尽管 Oxford Nanopore Technologies(ONT)测序平台提供了 TAT≤6 小时的测序和检测分析方案,但相较于 Illumina 二代测序方法,依然存在测序深度和 Reads 产出较低,成本较高和测序错误率较高等不足。在面对各种疑似感染病症时,临床医生始终有快速、准确鉴定病原体的迫切需求,因此,提升 mNGS 检测时效性成为了临床病原微生物检验关注的重点。

研究结果

改进测序接头结构,实现 “快速、实时”mNGS 分析

图 1 通过对测序接头的改进,实现不影响测序质量前提下的快速、实时分析

受到现有测序接头和测序原理的限制,NGS 只能先获取全部样本的测序数据,再根据标签序列进行数据拆分,最后完成序列比对分析,该固有流程是导致二代测序实验 TAT 较长的主要因素之一。本研究创新性地改良了测序接头的结构,接头中插入了一段样本特异的内部标签序列(Internal Index),实现了对内部标签序列进行优先测序和测序数据的提前拆分分析。为了避免这种接头设计导致的核苷酸多样性缺失、测序质量不佳、产出数据不足的问题,研究者们组合搭配了三种不同长度(6、7 和 8bp)的内部标签(图 1)。这样的设计能在保证测序质量的前提下,提前拆分分析样本测序数据,实现快速实时的 mNGS 分析。

自动化+实时生信分析,最快 9.1 小时完成 mNGS 全流程

图 2 改良的接头设计,结合自动化建库设备和生信实时分析流程,最终实现快速 mNGS

完成测序接头的改良后,研究者开发了一套快速 mNGS 检测方案,包括自动化文库制备、Illumina NextSeq 测序平台和实时分析系统(图 2)。实时分析监控程序全程监测测序进度,并根据测序循环数调度分析任务。后续的性能验证证实了改良的测序接头实现了快速检测,在 NextSeq 测序平台的全流程 TAT 降低到了 9.1~10.1 小时 (图 3,测序耗时约 6.1 小时,湿实验耗时 3~4 小时)。而使用常规接头,仅测序单一步骤耗时就达到约 11.7 小时,全流程周转时间至少在 15 小时以上。

图 3 测序分析耗时对比(改良的接头 vs 经典 TruSeq 接头)

准确性评估

图 4 利用真实临床样本完成新方法的性能评估

为了进一步缩减测序时间、并评估整套实验流程的准确性,研究者使用改良后的测序接头对 153 个下呼吸道标本进行了快速实时 mNGS 检测分析。研究者们综合了标本的临床培养、16S/ITS 测序、PCR-sanger 测序和病毒的 qPCR 验证结果,形成一套复合标准,用于评价快速 mNGS 报告和常规 mNGS 报告的准确性(图 4)。

图 5 快速 mNGS 和常规 mNGS 结果的准确性评估

如图 5 所示,基于复合参考标准,快速 mNGS 的细菌检测能力达到了阳性符合率 85.1%,阴性符合率 100%;真菌检测能力达到了阳性符合率 80.3%,阴性符合率 97.4%;病毒检测能力达到了阳性符合率 96.8%,阴性符合率 98.0%。

总结

本研究基于太阳2注册中心 mNGS 自动化解决方案,创新开发了改良的测序接头和实时快速分析系统,以 9.1 小时首次刷新了 Illumina NextSeq 测序平台下的 mNGS 检测速度,性能验证结果证实这项 “既快又准” 的 mNGS 检测技术有望为疑难、危重、特殊感染患者的救治提供更及时、更精准、更全面的诊疗线索,开创临床感染精准诊疗的新局面。